檢測細胞因子是判斷機體免疫功能的一個重要指標。運用熒光標記的抗細胞因子單抗進行胞內流式分析(Intracellular Flow Cytometry,ICFC)結合熒光標記的抗細胞表面抗原單抗應用,不僅可以檢測單個細胞內的多種因子,還可區(qū)分表達特定細胞因子的細胞亞群。

      應用ICFC檢測細胞因子的一般步驟:

       （1）活化細胞：淋巴細胞、嗜堿細胞、嗜酸細胞、抗原提呈細胞(如樹突狀細胞和纖維細胞)均可產(chǎn)生細胞因子。目前用于流式細胞術檢測的多是淋巴細胞、PBMC和全血。除在病理情況下, 對過高表達的細胞因子可直接取樣品細胞進行檢測外,通常檢測細胞因子一般都需要先激活細胞。PMA 和離子霉素為常用的激活劑, 他們可作用于蛋白激酶C ( PKC）使細胞活化并產(chǎn)生細胞因子。待檢細胞同激活劑共孵育的時間因細胞類型的不同而異, 一般孵育4～6 h足夠。值得注意的是, 一些細胞可因PMA和離子霉素的刺激而死亡, 且隨著孵育時間
的延長(超過24 h)死亡的細胞數(shù)增多。死亡的細胞可釋放DNA鏈, 誘導其他細胞形成細胞團而干擾對后續(xù)步驟的分析, 并可嚴重影響檢測的結果, 因此, 必須控制細胞的死亡數(shù)。

      （2）抑制蛋白轉運　在激活細胞的同時, 需用細胞內蛋白轉運抑制劑(常用的是Monensin和Brefeldin A)使其產(chǎn)生的蛋白質積聚在細胞內, 以增加檢測信號的強度。但由于Monensin和BFA具有時間- 劑量依賴的細胞毒性, 因此處理細胞的時間不能過長, Monensin的處理時間若超過12 h, 可對細胞產(chǎn)生毒性。若需長時間激活細胞, 應在激活的最后階段加入抑制劑。若以抗原肽作為刺激物, 由于不需要抗原加工的過程, 因此, 從一開始孵育細胞時, 就加入BFA。對于大多數(shù)細胞因子, BFA 和Monensin這兩種蛋白轉運抑制劑都一樣有效, 但也有例外, 如BFA用于檢測TNF-α效果最好; 而在用LPS作為激活劑檢測人PBMC分泌的IL-10時應該用Monensin, 否則將檢測不到IL-10。

      （3）封閉Fc受體　許多細胞表面表達Fc受體, 如B細胞、NK細胞、粒細胞、單核細胞、巨噬細胞及血小板等。他們會非特異性地結合檢測抗體的Fc段造成高背景, 因此, 封閉Fc受體的目的在于減少非特異性免疫熒光染色。在用IgFc受體的封閉試劑處理細胞時, 對人和大鼠細胞可用過量與熒光抗體來源相同、但亞型無關的純化Ig或血清, 來阻斷Fc受體;而對小鼠細胞可用純化的抗CD16 /32 抗體直接染色以封閉Fc受體。

      （4）細胞表面分子染色 T細胞表面可表達CD3、CD4或CD8分子, 但BFA和Monensin都可能影響細胞表面分子的表達,如BFA可使CD4的表達下調, 也可抑制大多數(shù)CD3 +細胞表面表達CD69, 但不影響細胞內CD69的表達; 而Monensin則不會顯著抑制細胞表面CD69的表達。其他如CD3、CD8、TCR也可受到影響。所以, 目前多采用淋巴細胞和中性粒細胞早期活化的標志CD69, 作為鑒定活化T細胞的表面標志。

      （5）固定和破膜　固定和破膜一般同時進行。固定細胞是細胞因子檢測步驟中極為關鍵的環(huán)節(jié)。常用的固定劑多聚甲醛能保護細胞形態(tài)的完整性和細胞內物質的抗原性, 也可防止破劑滲入細胞。由于一些細胞表面分子在經(jīng)多聚甲醛處理后會遭破壞, 所以應在細胞表面分子染色后再適時加入固定劑。常用的破膜劑是皂角苷, 如果沒有皂角苷的滲透作用, 熒光素標記的抗體只能與細胞外或細胞表面的抗原結合。破膜劑可增加細胞膜的通透性, 在細胞膜上形成傳遞通道, 熒光素標記的抗體便可通過細胞膜和細胞質滲入到內質網(wǎng)上的高爾基復合體, 與細胞因子或胞內其他分子結合。

     （6）細胞內細胞因子染色　固定和破膜后, 對細胞因子進行熒光染色最常用的為PE、FITC標記的抗體和APC標記的抗體。由于不同抗體所針對的抗原表位不同, 應選用不同的熒光素標記。對于弱表達的抗原(如IL-4)的檢測, 應選用強的熒光素PE標記抗體; 對高表達的IFN-γ的檢測推薦用FITC標記抗體。

    （7）上機檢測 洗滌細胞后, 通過三色或四色的多參數(shù)流式細胞分析。檢測的數(shù)據(jù)是表面Marker和細胞因子雙陽性的細胞數(shù)占所設定細胞數(shù)的百分率。

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